稳转株筛选实验服务
一、实验目的
稳转株筛选实验服务的主要目的是获得能够长期稳定表达特定基因或干扰特定基因表达的细胞系，以便于长期观察和检验基因对细胞功能以及蛋白相互作用的影响。
二、实验原理
通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并随细胞分裂稳定传递。最后用载体中所含的抗性基因进行筛选，以获得稳定表达目标基因的细胞株。
三、实验步骤
目标基因选择：
确定需要在细胞中稳定表达的目标基因。
构建质粒，将目标基因与抗性基因结合。
载体选择：
使用能够整合到宿主基因组中的载体，如慢病毒载体或逆转录病毒载体。
质粒载体也可用于实验，但需要较高效的转染方法和筛选策略。
转染方法：
根据细胞类型选择适合的转染方法，如脂质体转染、电穿孔等。
对于某些细胞，可能需要使用慢病毒或逆转录病毒感染。
优化条件：
优化转染条件，包括DNA浓度、细胞密度和转染试剂用量，以提高转染效率。
确定适合的MOI（感染复数），以确保高效的基因整合和表达。
筛选抗性基因：
在转染或感染后的24-48小时，添加选择性抗生素或药物（如G418、meifensuanzhi等），浓度需根据预先的滴定实验确定。
筛选通常持续1-2周，直到未转染的细胞被杀死，而转染成功的细胞存活下来。
稀释单克隆筛选：
如果需要获取单克隆稳转株，将筛选后的细胞进行极限稀释，接种到96孔板中，每孔接种单个细胞。
待单细胞克隆长成小群体后，通过显微镜观察并挑选生长良好的克隆进行进一步扩增。
验证表达：
提取筛选后细胞的RNA和蛋白，通过qRT-PCR和Western blot检测目标基因的mRNA和蛋白表达水平。
如果目标基因带有荧光标签（如GFP），可以通过荧光显微镜直接观察表达和定位。
使用PCR或Southern blot检测目标基因是否整合到宿主基因组中。
细胞功能分析：
根据研究目的，进行相关的功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等，验证目标基因在稳转株中的生物学功能。
长期稳定性检测：
持续培养稳转株，定期检测目标基因的表达水平，评估其在长期培养中的稳定性。
