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    接下来为你讲解ELISA检测流程之夹心法

    发布时间: 2022-06-25  点击次数: 208次
     
      ELISA检测样本包括血清、血浆、尿液、胸腹水、灌洗液、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等标本,灵敏度*。在收集标本前都必须有一个完整的计划,必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜标本尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时储存在49C备用,如有特殊原因需要周期收集标本,请造模取材后,将标本及时分装后放在20℃或70°C条件下保存。因冰室与室温存在一定温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以避免反复冻融。
      ELISA检测之夹心法:
      1、加样:将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100μL。待测样品加入到其他孔,每孔100μL(若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜,37℃孵育90分钟。提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。
      2、s物素化抗体/抗原:弃去液体,甩干,不用洗涤。每个孔中立即加入物素化抗体/抗原工作液100μL,混匀,酶标板加上覆膜,37℃孵育1小时。
      3、洗涤:甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350μL,浸泡1-2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示:此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。
      4、HRP酶结合物:每孔加酶结合物工作液100μL,混匀,加上覆膜,37℃孵育30分钟。
      5、洗涤:弃去孔内液体,洗板5次,方法同步骤3。
      6、底物:每孔加底物溶液(TMB)90μL,混匀,加上覆膜,37℃避光孵育15分钟左右。提示:根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
      7、终止:每孔加终止液50μL,终止反应。提示:终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
      8、读值:立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热,设置好检测程序。
      9、实验完毕后,将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。
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