KO first小鼠模型构建
一、KO-first 载体设计原理
KO-first载体通过精巧的基因陷阱（Gene Trap）和条件性模块设计，实现"三位一体"功能：
野生型基因
KO-first等位基因
传统KO
条件性KO
报告基因过表达
核心元件：
5'同源臂（1.5-3 kb）
SA-βgeo-pA（剪接受体-β半乳糖苷酶/新mei素抗性融合基因）
floxed 关键外显子（通常第2-4号外显子）
3'同源臂（1.5-3 kb）
FRT-flanked NeoR（用于阳性筛选，后续可切除）
二、KO first小鼠模型构建流程（以ES细胞同源重组为例）
1. 靶向载体构建
设计要点：
关键外显子两侧插入loxP位点（间距通常1-2 kb）
在5'UTR插入SA-βgeo实现基因陷阱（组成型KO）
NeoR两侧加入FRT位点便于后续Flp删除
改造
野生型基因: Exon1-Exon2-Exon3
KO-first等位基因: SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-FRT-NeoR-FRT
2. ES细胞打靶
电转与筛选：
线性化载体电转至JM8A3.N1等ES细胞
G418（NeoR）阳性筛选7-10天
克隆验证：
5'端PCR：F1（同源臂外侧） + R1（βgeo内）
3'端PCR：F2（NeoR内） + R2（同源臂外侧）
Southern blot确认单拷贝整合
3. 获得嵌合体小鼠
囊胚注射：将阳性ES细胞注入C57BL/6N囊胚
嵌合体鉴定：毛色嵌合（129Sv ES细胞→B6背景）
4. 传代与品系建立
第一步交配：嵌合体（公鼠）× WT（母鼠）
获得F1代（SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP，NeoR+）
第二步交配：F1 × Flp deleter小鼠（删除NeoR）
获得"clean" KO-first小鼠（仅保留SA-βgeo和loxP）
三、三种应用模式切换
1. 传统KO（组成型敲除）
机制：SA-βgeo阻断基因转录，导致功能wan全丧失
验证方法：
β-gal染色（报告基因表达）
Western blot检测目标蛋白缺失
2. 条件性KO（组织特异性敲除）
交配策略：
× Cre
KO-first
cKO
关键点：
Cre介导的loxP重组删除floxed外显子
需验证目标组织中的敲除效率（qPCR/免疫组化）
3. 报告基因过表达
利用SA-βgeo：
β-gal活性反映内源基因表达模式
可用于细胞谱系追踪
4. 恢复野生型（可选）
与Flp deleter小鼠交配可删除SA-βgeo，恢复野生型等位基因
四、技术优势与局限性
优势 | 挑战 |
一个模型实现三种功能 | 载体构建复杂（需专业设计） |
避免多品系重复构建 | ES细胞打靶周期长（6-12个月） |
国际标准化（IKMC资源可获取） | βgeo可能影响邻近基因表达 |
五、关键优化策略
外显子选择：
优先选择编码关键功能域的外显子
确保删除后引起移码突变（如外显子2/3）
减少背景干扰：
使用自我删除型NeoR（如neo-DTA）
选择高重组效率ES细胞系（如JM8A3.N1）
表型分析对照：
必须包括：WT、KO-first纯合子、KO-first × Cre
六、经典应用案例
Tsc1 KO-first模型：
传统KO：胚胎致死（研究发育功能）
Nestin-Cre cKO：神经发育缺陷
β-gal报告基因：揭示Tsc1在脑区的表达模式
p53 KO-first模型：
传统KO：自发肿瘤表型
K14-Cre cKO：研究皮肤特异性肿瘤发生
