一、同源重组实验定义与分子机制
同源重组是一种依赖DNA序列相似性（同源臂）的精准基因编辑技术，通过外源载体与宿主基因组间的序列交换实现靶向修饰。其核心机制包括：
同源臂介导的精准定位
外源载体两端设计≥1 kb的同源臂（与靶基因侧翼序列一致），引导载体与基因组特异性结合（避免随机插入）。
DNA断裂修复与交换
内源核酸酶（如Cas9）或自发损伤诱导 双链断裂（DSB） → 细胞启动同源定向修复（HDR） → 以载体为模板合成新链，实现基因替换/插入。
关键分子参与者
RecA/Rad51：介导DNA链配对与交换
BRCA1/2：调控修复路径选择（HR vs. NHEJ）
生物学意义：HR是wei一能实现单碱基至大片段精准替换的自然修复机制，区别于易出错的非同源末端连接（NHEJ）。
二、同源重组实验技术流程与关键步骤
1. 载体设计策略
| 元件 | 功能 | 案例 |
|---|---|---|
| 长同源臂 | 提升重组效率（1-10 kb） | 小鼠基因敲除常用3 kb臂 |
| 正筛选标记 | 新霉su抗性（Neo^R）等，筛选重组细胞 | 中的"Selection"标记 |
| 负筛选标记 | HSV-TK（更昔luo韦敏感），淘汰随机插入细胞 | 中的Gancyclovir反选 |
| 条件性删除系统 | Cre/loxP或FLP/FRT，移除筛选标记 | 的LOXP重组 |
2. 细胞工程化改造
胚胎干细胞（ESC）打靶：
电穿孔导入线性化载体 → G418筛选阳性克隆
PCR/Southern验证重组位点（避免随机整合）
CRISPR-HR联用：
Cas9切割靶位点 → 同步提供HR模板（效率提升50倍）
3. 动物模型构建流程
注：传统ESC/HR流程需6-12个月，CRISPR-HR可缩短至3个月。
三、应用场景与突破案例
1. 疾病模型构建
| 模型类型 | 技术方案 | 疾病研究价值 |
|---|---|---|
| 基因敲除小鼠 | HR替换致病基因为终止子 | 囊性纤维化、癌症机制研究 |
| 点突变模型 | HR引入特定SNP（如APOE4） | 阿尔茨海默症药物筛选 |
| 人源化模型 | HR插入人类基因片段（如IL-2） | 免yi治疗评估 |
2. 生物医药生产
治疗性蛋白载体：
HR将人抗凝xue酶III基因插入山羊β-酪蛋白位点 → 乳汁中表达药用蛋白（产量>1g/L）
基因治疗修复：
HR修正β-珠蛋白突变 → 治疗β-地中海贫血（临床前阶段）
3. 合成生物学
染色体工程：
Cre/loxP介导大片段重组 → 构建环形人工染色体（中的MI系统）
