麻醉后的大鼠固定于脑立体定位仪，具体操作为大鼠上门齿卡入横杆，调节旋钮压紧鼻杆；将耳杆插入大鼠耳道，平衡调节左、右耳杆，使大鼠两耳间连线与耳杆在同一直线上，保证左、右耳杆的刻度位置相同后调节旋钮锁紧耳杆。大鼠固定完好的判断标准：鼻对正中，头部不动，提尾不掉，目测大脑放置水平（使颅骨水平）。
眼科剪纵向剪开大鼠头部皮肤约3cm，用镊子沿颅骨表面剥离骨膜结缔组织并剪除，用无菌棉球蘸去浸出的血液，将颅骨表面清理干净，暴露前后囟。
调节脑定位仪上横纵坐标旋钮使牙科微孔钻位于前囟点上方并轻触该点，以Bregma点作为三维坐标系的参考点（零点）。
根据注射位置的不同，及大鼠重量的不同，注射坐标不同。此处以普通SD大鼠（350±50g）侧脑室注射为例，通过查询脑立体定位图谱确定需要定位的核团位置，确定坐标值，即ML值（X轴）、AP值（Y轴）、DV值（Z轴）。侧脑室位置为前囟点旁开1.5mm，向后囟方向1.1mm ，深4.5mm（坐标即为±1.5，-1.1，-4.5）。调节X轴（1.5个单位）及Y轴（1.1个单位）旋钮移动操作臂到坐标位置，使用微孔牙科钻缓慢打孔。钻孔另一种操作法为确定钻孔位置后在该点蘸墨打点标记，后手持牙科钻进行钻孔。颅骨钻穿时有明显落空感，此时应小心操作避免伤及硬脑膜。
固定微量注射器，调节Z轴旋钮（4.5个单位）使微量注射器针头插入侧脑室。进行缓慢注射，注射速度2 ul/min，注射剂量视具体实验而定，一般在5ul左右。
注射完成后留针静置10min以便药液充分吸收。缓慢调节Z轴旋钮向上拔出针头，钻孔处涂抹骨蜡。
缝合皮肤，完成脑定位注射。
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